Voie de signalisation NF-kappaB dans la régulation de la transcription du VIH-1 et du HCMV dans les macrophages (NF-kappaB signaling in transcriptional regulation of HIV-1 and HCMV in macrophages)

Khan, Kashif Aziz - (2010-03-26) / Université de Franche-Comté - Voie de signalisation NF-kappaB dans la régulation de la transcription du VIH-1 et du HCMV dans les macrophages en : Anglais Directeur(s) de thèse:  Herbein, Georges Laboratoire : Agents pathogènes et inflammation Ecole doctorale : HES Classification : Médecine et santé

URL d'accès :  http://indexation.univ-fcomte.fr/nuxeo/site/esupve... Mots-clés : NF-κB, Bcl-3, transcription, macrophages, HCMV, VIH, VHC, protéine Nef, protéine Core Résumé : Le facteur de transcription NF-kappaB (NF-κB) constitue une famille de cinq protéines qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment l'immunité, l'inflammation, le développement, et l'apoptose. Les membres de la famille NF-κB comprennent les protéines p65, RelB, c-Rel, p50 et p52, qui forment des homo- et des hétérodimères. La facteur de transcription NF-κB est normalement séquestré dans le cytoplasme, en association avec les membres de la famille IκB (inhibitor of kappa B). La phosphorylation et l'ubiquitination médiée par IKK (IκB Kinase) conduisent à la dégradation de IκB et à la translocation de NF-κB dans le noyau où la régulation transcriptionnelle des gènes cibles a lieu. L'activation de IKK est tributaire entre autres des protéines adaptatrices TRAF et RIP. Ainsi la voie de signalisation NF-κB se compose des dimères NF-κB, des protéines IκB, du complexe IKK et des protéines adaptatrices. L'activation de la voie de signalisation NF-κB est fréquente au cours des infections virales. NF-κB étant un composant essentiel de la réponse immunitaire innée antivirale, il participe à la réaction de l'hôte contre les agents pathogènes. Les virus ont développé des stratégies pour moduler la voie de signalisation NF-κB en leur faveur notamment pour faciliter leur réplication, empêcher l'apoptose des cellules infectées et favoriser l’échappement à la réponse immunitaire. Par ailleurs les virus ont incorporé des sites de fixation de NF-κB dans leurs promoteurs. Ainsi l'activation de NF-κB résulte en une transactivation des promoteurs viraux et en une transcription virale augmentée. En effet de nombreux virus et certaines protéines virales activent ou inhibent la voie de signalisation NF-κB pour créer un environnement favorable au développement du cycle viral dans la cellule hôte. Dans la première partie de notre étude, nous nous sommes intéressés au rôle du facteur de transcription NF-κB dans la transcription du cytomégalovirus humain (HCMV) en infectant des macrophages dérivés de monocytes sanguins (MDMs). Les macrophages jouent un rôle important dans la pathogénèse liée à HCMV et l’effet de l’infection virale sur la signalisation cellulaire dans ces cellules reste peu documenté. Nous avons montré que les souches virales AD169 (souche de laboratoire) et HCMV-DB (souche issue d’un isolat clinique) pouvaient se multiplier dans des cultures de cellules primaires MDMs mais que le titre viral demeurait inférieur à celui observé dans des cellules plus permissives telles que les fibroblastes de la lignée MRC5. Etant donné que le facteur de transcription NF-κB joue un rôle essentiel dans la réplication virale notamment par la transactivation du promoteur viral très précoce IE et du gène tardif viral, nous avons étudié l’activation et la composition du complexe NF-κB dans des cellules MDMs et des fibroblastes MRC5 infectés par HCMV. Par des techniques de retard sur gel (EMSA) et de colorimétrie (Microwell colorimetric NF-κB assay), nous avons montré que l’infection par HCMV entraînait une activation du complexe p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs alors qu’il activait le complexe classique NF-κB p50/p65 dans les fibroblastes de la lignée MRC5. L’utilisation des cellules monocytoides U937 transfectées par un vecteur pCMV-Luc, vecteur d’expression de la luciférase sous la dépendance du promoteur viral du gène très précoce EA (MIEP), nous a permis de montrer que le complexe p52/Bcl-3 activait le promoteur viral MIEP. Par la technique d’immunoprécipitation de chromatine (technique ChIP), nous avons mis en évidence l’interaction entre le complexe p52/Bcl-3 et le MIEP dans les cellules MDMs infectées par le HCMV. Ainsi, l’activation du complexe NF-κB p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs pourrait être à l’origine de la réplication limitée d’HCMV dans ces cellules. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons étudié le rôle de NF-κB dans la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors de la co-infection par le virus de hepatite C (VHC) et le VIH-1. L’infection par VIH favorise l’évolution de l’hépatite C chronique et augmente la charge virale VHC, mais le rôle d’VHC sur la réplication virale du VIH reste mal connu. Les cellules mononuclées périphériques (PBMC) sont permissives aux virus VIH et VHC et peuvent constituer un réservoir extra-hépatique de virions. Il a été montré que la transcription de NF-κB est activée lors de l’infection par VHC et VIH-1. Nous nous sommes proposés d’étudier le rôle de NF-κB sur la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors d’une co-infection VHC/VIH-1. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que la charge virale VIH-1 était plus élevée dans les cellules PBMC et MDMs provenant de sujets co-infectés que chez les sujets mono-infectés. Nous avons observé, in vitro, que les protéines Nef du VIH-1 et Core du VHC activent le complexe p50/p65 de NF-κB dans les cellules MDM. Grâce à une technique reposant sur l’expression de la luciférase, nous avons montré que les deux protéines activaient la transcription du LTR de VIH-1. Nous avons également demontré que les protéines Nef et Core activent la réplication du VIH-1 dans les cellules promonocytaires chroniquement infectés U1. De plus, ces protéines stimulaient également le réplication du VIH-1 dans des macrophages primaires infectés par VIH-1. Par conséquent, les deux protéines Nef et Core pourraient favoriser la formation de réservoirs cellulaires contenant les deux virus. L’ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre le rôle de NF-κB dans la transcription virale au sein des macrophages. Résumé (anglais) : The mammalian nuclear factor-κB (NF-κB) is a family of five DNA-binding proteins that regulates expression of a large number of genes involved in diverse biological functions including immunity, inflammation, development, and apoptosis. Members of NF-κB family include p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 (NF-κB1) and p52 (NF-κB2), which are found as homoand heterodimers. The transcription factor NF-κB is normally sequestered in the cytoplasm in association with the members of the inhibitor of kappa B (IκB) family. IκB kinase (IKK) mediated phosphorylation, ubiquitination, and degradation of IκB frees NF-κB to translocate to the nucleus to regulate the transcription of target genes. Activation of IKK is dependent upon intracellular adapter proteins such as TRAF and RIP. Thus NF-κB pathway consists of NF-κB dimers, IκB proteins, IKK complex and intracellular adapter proteins. Activation of NF-κB is a common feature during viral infections. NF-κB is an essential component of innate antiviral immune response and is a part of the protective reaction of the host against pathogens. Viruses have evolved strategies to modulate NF-κB signaling pathway for their own benefit especially to facilitate their replication, prevent apoptosis of infected cells and evasion of immune responses. In addition a number of viruses contain NF-κB binding sites in their promoters. Thus activation of NF-κB results in the transactivation of viral promoters, thus enhancing viral transcription and replication. In fact several viruses and a number of viral proteins have been reported either to stimulate or inhibit NF-κB activation to create an environment for successful viral life cycle in the host cell. In the first part of our study we studied the role of NF-κB in the transcription and replication of HCMV in primary human monocyte-derived macrophages (MDMs). Monocytes/macrophages are key cells in the pathogenesis of human cytomegalovirus (HCMV) infection, but the in vitro rate of viral production in MDMs is considerably lower than in fibroblasts. Considering that the NF-κB signaling pathway is potentially involved in the replication strategy of HCMV through efficient transactivation of the major immediate-early promoter (MIEP), efficient viral replication, and late gene expression, we investigated the composition of the NF-κB complex in HCMV-infected MDMs and fibroblasts. Preliminary studies showed that HCMV could grow in primary MDMs culture but that the viral titer in culture supernatants was lower than that observed in the supernatants of more permissive MRC5 fibroblasts. EMSA and microwell colorimetric NF-κB assay demonstrated that HCMV infection of MDMs increased p52 binding activity without activating the canonical p50/p65 complex. Moreover, Bcl-3 was up-regulated and was demonstrated to associate with p52, indicating p52/Bcl-3 complexes as the major component of the NF-κB complex in MDMs. Luciferase assays in promonocytic U937 cells transfected with an MIEP-luciferase reporter construct demonstrated MIEP activation in response to p52 and Bcl-3 overexpression. Chromatin immunoprecipitation assay demonstrated that p52 and Bcl-3 bind the MIEP in acutely HCMVinfected MDMs. In contrast, HCMV infection of MRC5 fibroblasts resulted in activation of p50/p65 heterodimers. Thus, activation of p52/Bcl-3 complexes in MDMs and p50/p65 heterodimers in fibroblasts in response to HCMV infection might explain the low-level growth of the virus in MDMs vs efficient growth in fibroblasts. In the second part of our study we studied the role of NF-κB in the transcription and replication of HIV-1 in macrophages during HIV-1/ hepatitis C virus (HCV) coinfection. HIV-1 infection favors the progression of HCV disease and enhances the viral load of HCV but the effect of HCV on replication of HIV-1 is not well studied. Macrophages are permissive to HCV and HIV-1 infection so can constitute extra-hepatic reservoir of these viruses. As transcription factor NF-κB is activated during HIV-1 and HCV infection we studied the role of NF-κB in the transcription of HIV-1 in MDMs. Preliminary studies from our laboratory demonstrate higher levels of HIV-1 viral load in MDMs isolated from the peripheral blood of HIV-1/HCV coinfected subjects in comparison with HIV-1 mononinfected patients. To assess the potential role of HIV-1 Nef and HCV core proteins in this phenomenon, we studied their respective role in regard to NF-κB activation and HIV-1 replication in primary macrophages. Following the treatment of primary macrophages with exogenous HIV-1 Nef and HCV core proteins, we observed activation of NF-κB in primary macrophages which consist of p50/p65. Consistently, degradation of IκBα, and phosphorylation of IKKα, IKKβ was observed in response to both HIV-1 Nef and HCV core protein. In addition, HIV-1 Nef and HCV core proteins stimulated synergistically the HIV-1 long terminal repeat (LTR), and subsequently enhanced HIV-1 replication in both chronically infected promonocytic U1 cells and acutely HIV-1 infected MDMs. Therefore, our results indicate that HIV-1 Nef and HCV core proteins synergize to enhance NF-κB activation and HIV-1 replication in primary macrophages and thereby could fuel the progression of the HIV-1 disease in HIV/HCV coinfected patients. All together, our results have important implication in terms of viral persistence and formation of viral reservoirs in macrophages during chronic viral infections. Identifiant : UFC-53

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