Divers facteurs de risques ont été incriminés dans la genèse des maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI). Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les facteurs qui pourraient contribuer à la survenue de maladie de Crohn (MC) ou de rectocolite hémorragique (RCH) au sein d'une cohorte prospective. La cohorte E3N est une cohorte de 98997 femmes âgées de 40 à 65 ans, affiliées à la Mutuelle Générale de l'Éducation Nationale suivies prospectivement depuis 1990. Des variables liées à l'environnement étaient recueillies à l'entrée dans l'étude incluant un interrogatoire alimentaire détaillé. Des questionnaires auto administrés tous les deux ans recueillaient les évènements de vie, les maladies chroniques et cancers. Les données concernant les MICI étaient recueillies tous les deux ans jusqu'au dernier questionnaire (juin 2005). 123 femmes ont déclaré un cas incident de MICI après l'inclusion dans la cohorte dont 77 après remplissage du questionnaire alimentaire. Un excès d'apport de protéines était statistiquement corrélé au risque de survenue de MICI (Hazard ratio (HR) pour le 3ème vs. le 1er tertile = 3,31 ; IC à 95% : 1,41-7,77 ; p trend = 0,007). Cette association était exclusivement liée aux protéines animales (HR pour le pour le 3ème vs. le 1er tertile = 3,03 ; IC à 95% : 1,45-6,34 ; p trend = 0,005). L'analyse des classes d'apports protéiques révélait que l'apport de viande et de poissons était corrélé à un risque élevé de survenue de MICI contrairement à l'apport d'oeufs ou de produits laitiers. Par ailleurs, sur l'ensemble de cette cohorte, une forte exposition solaire surtout en hiver, était associée à une diminution du risque de MC (HR pour le 3ème vs. le 1er tertile = 0,46 ; IC à 95% : 0,22 à 0,98 ; p de trend = 0,03) mais pas de RCH. L'ajustement sur l'activité physique, le tabagisme, la prise de traitements hormonaux, l'index de masse corporelle et le niveau socioéconomique ne modifiaient pas notablement ces deux principaux résultats. Une analyse multivariée (prenant en compte le niveau d'UV, la consommation de protéines, l'apport en vitamine D et l'apport calorique) incluant les patientes atteintes de MC ayant rempli le questionnaire alimentaire à l'inclusion (n = 35) et les non cas (n = 70987) était effectuée. Le risque de MC était diminué chez les femmes qui avaient un niveau élevé d'exposition solaire (HR = 0,32; IC à 95% : 0,13 à 0,81 ; p de trend = 0,01 et celles qui avaient un apport élevé en vitamine D (HR = 0,40; IC à 95% : 0,15 à 1,03 ; p de trend = 0,07).

Le facteur de transcription NF-kappaB (NF-κB) constitue une famille de cinq protéines qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment l'immunité, l'inflammation, le développement, et l'apoptose. Les membres de la famille NF-κB comprennent les protéines p65, RelB, c-Rel, p50 et p52, qui forment des homo- et des hétérodimères. La facteur de transcription NF-κB est normalement séquestré dans le cytoplasme, en association avec les membres de la famille IκB (inhibitor of kappa B). La phosphorylation et l'ubiquitination médiée par IKK (IκB Kinase) conduisent à la dégradation de IκB et à la translocation de NF-κB dans le noyau où la régulation transcriptionnelle des gènes cibles a lieu. L'activation de IKK est tributaire entre autres des protéines adaptatrices TRAF et RIP. Ainsi la voie de signalisation NF-κB se compose des dimères NF-κB, des protéines IκB, du complexe IKK et des protéines adaptatrices. L'activation de la voie de signalisation NF-κB est fréquente au cours des infections virales. NF-κB étant un composant essentiel de la réponse immunitaire innée antivirale, il participe à la réaction de l'hôte contre les agents pathogènes. Les virus ont développé des stratégies pour moduler la voie de signalisation NF-κB en leur faveur notamment pour faciliter leur réplication, empêcher l'apoptose des cellules infectées et favoriser l’échappement à la réponse immunitaire. Par ailleurs les virus ont incorporé des sites de fixation de NF-κB dans leurs promoteurs. Ainsi l'activation de NF-κB résulte en une transactivation des promoteurs viraux et en une transcription virale augmentée. En effet de nombreux virus et certaines protéines virales activent ou inhibent la voie de signalisation NF-κB pour créer un environnement favorable au développement du cycle viral dans la cellule hôte. Dans la première partie de notre étude, nous nous sommes intéressés au rôle du facteur de transcription NF-κB dans la transcription du cytomégalovirus humain (HCMV) en infectant des macrophages dérivés de monocytes sanguins (MDMs). Les macrophages jouent un rôle important dans la pathogénèse liée à HCMV et l’effet de l’infection virale sur la signalisation cellulaire dans ces cellules reste peu documenté. Nous avons montré que les souches virales AD169 (souche de laboratoire) et HCMV-DB (souche issue d’un isolat clinique) pouvaient se multiplier dans des cultures de cellules primaires MDMs mais que le titre viral demeurait inférieur à celui observé dans des cellules plus permissives telles que les fibroblastes de la lignée MRC5. Etant donné que le facteur de transcription NF-κB joue un rôle essentiel dans la réplication virale notamment par la transactivation du promoteur viral très précoce IE et du gène tardif viral, nous avons étudié l’activation et la composition du complexe NF-κB dans des cellules MDMs et des fibroblastes MRC5 infectés par HCMV. Par des techniques de retard sur gel (EMSA) et de colorimétrie (Microwell colorimetric NF-κB assay), nous avons montré que l’infection par HCMV entraînait une activation du complexe p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs alors qu’il activait le complexe classique NF-κB p50/p65 dans les fibroblastes de la lignée MRC5. L’utilisation des cellules monocytoides U937 transfectées par un vecteur pCMV-Luc, vecteur d’expression de la luciférase sous la dépendance du promoteur viral du gène très précoce EA (MIEP), nous a permis de montrer que le complexe p52/Bcl-3 activait le promoteur viral MIEP. Par la technique d’immunoprécipitation de chromatine (technique ChIP), nous avons mis en évidence l’interaction entre le complexe p52/Bcl-3 et le MIEP dans les cellules MDMs infectées par le HCMV. Ainsi, l’activation du complexe NF-κB p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs pourrait être à l’origine de la réplication limitée d’HCMV dans ces cellules. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons étudié le rôle de NF-κB dans la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors de la co-infection par le virus de hepatite C (VHC) et le VIH-1. L’infection par VIH favorise l’évolution de l’hépatite C chronique et augmente la charge virale VHC, mais le rôle d’VHC sur la réplication virale du VIH reste mal connu. Les cellules mononuclées périphériques (PBMC) sont permissives aux virus VIH et VHC et peuvent constituer un réservoir extra-hépatique de virions. Il a été montré que la transcription de NF-κB est activée lors de l’infection par VHC et VIH-1. Nous nous sommes proposés d’étudier le rôle de NF-κB sur la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors d’une co-infection VHC/VIH-1. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que la charge virale VIH-1 était plus élevée dans les cellules PBMC et MDMs provenant de sujets co-infectés que chez les sujets mono-infectés. Nous avons observé, in vitro, que les protéines Nef du VIH-1 et Core du VHC activent le complexe p50/p65 de NF-κB dans les cellules MDM. Grâce à une technique reposant sur l’expression de la luciférase, nous avons montré que les deux protéines activaient la transcription du LTR de VIH-1. Nous avons également demontré que les protéines Nef et Core activent la réplication du VIH-1 dans les cellules promonocytaires chroniquement infectés U1. De plus, ces protéines stimulaient également le réplication du VIH-1 dans des macrophages primaires infectés par VIH-1. Par conséquent, les deux protéines Nef et Core pourraient favoriser la formation de réservoirs cellulaires contenant les deux virus. L’ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre le rôle de NF-κB dans la transcription virale au sein des macrophages.

Le facteur de transcription NF-kappaB (NF-κB) constitue une famille de cinq protéines qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans diverses fonctions biologiques, notamment l'immunité, l'inflammation, le développement, et l'apoptose. Les membres de la famille NF-κB comprennent les protéines p65, RelB, c-Rel, p50 et p52, qui forment des homo- et des hétérodimères. La facteur de transcription NF-κB est normalement séquestré dans le cytoplasme, en association avec les membres de la famille IκB (inhibitor of kappa B). La phosphorylation et l'ubiquitination médiée par IKK (IκB Kinase) conduisent à la dégradation de IκB et à la translocation de NF-κB dans le noyau où la régulation transcriptionnelle des gènes cibles a lieu. L'activation de IKK est tributaire entre autres des protéines adaptatrices TRAF et RIP. Ainsi la voie de signalisation NF-κB se compose des dimères NF-κB, des protéines IκB, du complexe IKK et des protéines adaptatrices. L'activation de la voie de signalisation NF-κB est fréquente au cours des infections virales. NF-κB étant un composant essentiel de la réponse immunitaire innée antivirale, il participe à la réaction de l'hôte contre les agents pathogènes. Les virus ont développé des stratégies pour moduler la voie de signalisation NF-κB en leur faveur notamment pour faciliter leur réplication, empêcher l'apoptose des cellules infectées et favoriser l’échappement à la réponse immunitaire. Par ailleur les virus ont incorporé des sites de fixation de NF-κB dans leurs promoteurs. Ainsi l'activation de NF-κB résulte en une transactivation des promoteurs viraux et en une transcription virale augmentée. En effet de nombreux virus et certaines protéines virales activent ou inhibent la voie de signalisation NF-κB pour créer un environnement favorable au développement du cycle viral dans la cellule hôte. Dans la première partie de notre étude, nous nous sommes intéressés au rôle du facteur de transcription NF-κB dans la transcription du cytomégalovirus humain (HCMV) en infectant des macrophages dérivés de monocytes sanguins (MDMs). Les macrophages jouent un rôle important dans la pathogénèse liée à HCMV et l’effet de l’infection virale sur la signalisation cellulaire dans ces cellules reste peu documenté. Nous avons montré que les souches virales AD169 (souche de laboratoire) et HCMV-DB (souche issue d’un isolat clinique) pouvaient se multiplier dans des cultures de cellules primaires MDMs mais que le titre viral demeurait inférieur à celui observé dans des cellules plus permissives telles que les fibroblastes de la lignée MRC5. Etant donné que le facteur de transcription NF-κB joue un rôle essentiel dans la réplication virale notamment par la transactivation du promoteur viral très précoce IE et du gène tardif viral, nous avons étudié l’activation et la composition du complexe NF-κB dans des cellules MDMs et des fibroblastes MRC5 infectés par HCMV. Par des techniques de retard sur gel (EMSA) et de colorimétrie (Microwell colorimetric NF-κB assay), nous avons montré que l’infection par HCMV entraînait une activation du complexe p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs alors qu’il activait le complexe classique NF-κB p50/p65 dans les fibroblastes de la lignée MRC5. L’utilisation des cellules monocytoides U937 transfectées par un vecteur pCMV-Luc, vecteur d’expression de la luciférase sous la dépendance du promoteur viral du gène très précoce EA (MIEP), nous a permis de montrer que le complexe p52/Bcl-3 activait le promoteur viral MIEP. Par la technique d’immunoprécipitation de chromatine (technique ChIP), nous avons mis en évidence l’interaction entre le complexe p52/Bcl-3 et le MIEP dans les cellules MDMs infectées par le HCMV. Ainsi, l’activation du complexe NF-κB p52/Bcl-3 dans les cellules MDMs pourrait être à l’origine de la réplication limitée d’HCMV dans ces cellules. Dans la deuxième partie de notre étude, nous avons étudié le rôle de NF-κB dans la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors de la co-infection par le virus de hepatite C (VHC) et le VIH-1. L’infection par VIH favorise l’évolution de l’hépatite C chronique et augmente la charge virale VHC, mais le rôle d’VHC sur la réplication virale du VIH reste mal connu. Les cellules mononuclées périphériques (PBMC) sont permissives aux virus VIH et VHC et peuvent constituer un réservoir extra-hépatique de virions. Il a été montré que la transcription de NF-κB est activée lors de l’infection par VHC et VIH-1. Nous nous sommes proposés d’étudier le rôle de NF-κB sur la transcription du VIH-1 dans les cellules MDMs lors d’une co-infection VHC/VIH-1. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que la charge virale VIH-1 était plus élevée dans les cellules PBMC et MDMs provenant de sujets co-infectés que chez les sujets mono-infectés. Nous avons observé, in vitro, que les protéines Nef du VIH-1 et Core du VHC activent le complexe p50/p65 de NF-κB dans les cellules MDM. Grâce à une technique reposant sur l’expression de la luciférase, nous avons montré que les deux protéines activaient la transcription du LTR de VIH-1. Nous avons également demontré que les protéines Nef et Core activent la réplication du VIH-1 dans les cellules promonocytaires chroniquement infectés U1. De plus, ces protéines stimulaient également le réplication du VIH-1 dans des macrophages primaires infectés par VIH-1. Par conséquent, les deux protéines Nef et Core pourraient favoriser la formation de réservoirs cellulaires contenant les deux virus. L’ensemble de ces études nous a permis de mieux comprendre le rôle de NF-κB dans la transcription virale au sein des macrophages.

Bactérie opportuniste bien connue, Pseudomonas aeruginosa est un acteur majeur de l’infection broncho-pulmonaire chronique qui se développe chez les patients atteints de mucoviscidose (CF). Grâce à des mécanismes complexes, ce pathogène parvient à s’implanter dans les voies respiratoires des malades et à résister aux traitements antibiotiques, même les plus agressifs. L’analyse rétrospective d’une collection de souches du laboratoire de Bactériologie du CHU de Besançon a révélé chez la plupart des porteurs chroniques une diversification parfois extrême des profils de résistance au cours du temps. Les techniques de génotypage par l’analyse des microsatellites (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis), par la détection de Single Nucleotides Polymorphisms (puces Clondiag®) et par macrorestriction de l’ADN génomique (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) ont conduit à des résultats similaires pour la comparaison des isolats séquentiels provenant d’un même patient. Aucun clone n’était partagé entre les 6 patients, traduisant l’absence de contamination croisée pendant la période étudiée (1998-2006). Le plus souvent la souche de primo-colonisation évolue pour donner naissance à des sous-populations dont les niveaux de résistance fluctuent. Si certaines d’entres elles évoluent vers la multirésistance, d’autres, au contraire, deviennent hypersensibles à certains antibiotiques. Ainsi, dans près de 30 % des cas et chez près de un patient sur deux, les souches deviennent hypersensibles aux β-lactamines. Nous avons montré que ce phénotype particulier, nommé TicHS, analysé chez 11 isolats résulte d’un déficit dans le système d’efflux actif MexAB-OprM pouvant impliquer, soit la sous-expression du gène mexB (n=2), soit la production d’une protéine MexB (n=2) ou MexA (n=1) altérée. Chez d’autres isolats (n=6), le système MexAB-OprM est a priori intact, mais non fonctionnel. Par ailleurs, dans ce travail nous avons mis en évidence, pour la première fois, que P. aeruginosa peut s’adapter in vivo à la pression exercée par les aminosides en modifiant non plus, la quantité de systèmes d’efflux produite, mais la pompe elle-même. Par exemple, la substitution F1018L dans la protéine MexY du système MexXY(OprM) entraîne une augmentation de la résistance d’un facteur 2 vis-à-vis des substrats de la pompe (aminosides, céfépime, fluoroquinolones). Toutefois, cette substitution n’explique qu’en partie les hauts niveaux de résistance (augmentation des CMI d’un facteur 16) conférés par le système MexXY(OprM) chez certaines souches ce qui suggère la présence de mécanismes additionnels susceptibles de moduler l’efficacité de cette pompe.