Les greffes de cellules souches mésenchymateuses (CSM) dans les modèles animaux de pathologies humaines conduisent à une amélioration fonctionnelle, motrice et /ou cognitive. La prolifération des cellules souches neurales endogènes et l'inhibition de la mort cellulaire des cellules nouvellement générées sont certainement impliquées dans zes effets. Nous avons réalisé une analyse détaillée des comportements de cellules issues de la moelle osseuse (CMO) après transplantation in vivo et in vitro. Après injection de CMO dans la veine latérale de la queue, de nombreuses cellules ont migré dans l'encéphale et certaine ont acquis un phénotype neuronal ou glial. Nous avons ensuite développé un modèle in vitro de cultures organotypiques d'hippocampe "greffées" par des cellules de moelle osseuse. Nous avons utilisé de CMO ou des CSM sélectionnées après un ou cinq passages en culture, greffées directement sur les tranches ou utilisées en co-culture avec celle-ci. Puis nous avons analysé le transcriptome de ces trois populations cellulaires et avons trouvé que l'expression de nombreux gènes impliqués dans l'angiogésèse, la neurogenèse et la mort cellulaire variaient selon les fractions cellulaires. L'ensemble de nos résultats suggèrent que l'amplification cellulaire des cellules issues de la moelle osseuse affecte leur capacité à protéger les tranches d'hippocampe en culture. Ce travail permet d'avoir un aperçu des mécanismes impliqués dans l'établissement d'un micro-environnement favorable à la réparation tissulaire et donne des informations essentielles sur les conditions de sélection et d amplification indispensable à une future utilisation thérapeutique.

Ce mémoire rapporte nos résultats concernant l’étude d’une population de neurones producteurs d’un précurseur contenant les sites de clivage pour des peptides de la famille RFamide et appelés RFRP (RFRP-1 et -3). Ces peptides identifiés récemment dans le cerveau des rongeurs ont été impliqués chez d’autres espèces de vertébrés, et notamment chez les oiseaux, dans le contrôle de l’axe gonadotrope. Les objectifs de notre travail ont concerné : l’analyse de la distribution détaillée de ces neurones dans l’hypothalamus de rat, la recherche de co-expression de RFRP avec d’autres peptides et enzymes présents dans des neurones des mêmes territoires, la genèse des neurones producteurs de RFRP pendant le développement embryonnaire de rat, la recherche de certains liens anatomiques de ces neurones avec les systèmes neuroendocrines de l’hypothalamus, et leur intégration dans des circuits impliqués dans les comportements de défense. Enfin, des résultats préliminaires ont été obtenus concernant les fonctions dans lesquelles les neurones à RFRP pourraient être impliqués chez le rat. Ne disposant pas d’outils immunologiques, toutes les études de marquage des neurones à RFRP ont été réalisées par hybridation in situ en sonde froide. La technique au 5-bromo-2’- deoxyuridine (BrdU) a été utilisée pour l’étude de la neurogenèse de cette population. Des injections de traceurs antérograde (PHA-L) et rétrograde (fluorogold) ont permis d’étudier certains circuits impliquant les neurones à RFRP. Enfin, des mesures des taux d’ARNm RFRP par RT-PCR semi-quantitative ont été réalisées chez des animaux soumis à une privation alimentaire ou à un stress aigu par confinement. Les neurones à RFRP sont distribués dans sept noyaux exclusivement hypothalamiques, et plus particulièrement la capsule du noyau ventromédian où la majorité des périkaryons sont retrouvés. Les doubles marquages ont permis de visualiser des contacts étroits avec les populations de neurones à MCH et TH, sans co-expression. En combinant la méthode au BrdU à l’hybridation in situ, nous avons montré que les neurones à RFRP sont générés en un pic unique centré sur les stades embryonnaires E13-E14. L’étude de leur développement ontogénétique a aussi montré qu’ils acquièrent leur phénotype chimique tardivement. Par les techniques de traçage rétrograde (fluorogold), nous n’avons pas confirmé les données de la littérature sur un rôle majeur des neurones à RFRP dans les fonctions neuroendocriniennes. Par des techniques de traçage antérograde (PHA-L), le noyau antérieur de l’hypothalamus et le noyau latéral du septum ont été identifiés comme des sources majeures d’innervation des neurones à RFRP. Enfin, nous avons montré des variations significatives des taux d’expression de l’ARNm RFRP suite à un stress aigu. La population de neurones à RFRP forme une ‘condensation cellulaire’ en contact étroit avec les neurones à MCH et TH. Cette population est générée en un pic étroit à E14. Cette donnée a été comparée à celles du laboratoire concernant les populations de neurones à MCH et Hcrt. Elle suggère que l’hypothalamus tubéral est formé par des vagues successives de neurogenèse de populations neuronales qui se distinguent par leur phénotype chimique (MCH, Hcrt, RFRP). Enfin, les neurones à RFRP semblent être impliqués dans des circuits liés aux comportements de stress et de défense.

Les estrogènes contribuent au contrôle de l’expression de nombreux gènes cibles en interagissant avec les Récepteurs aux Estrogènes (RE). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription qui interagissent avec une séquence cis-régulatrice, appelée Elément de Réponse aux Estrogènes (ERE). Un criblage de molécules capables de lier les RE et de moduler l’expression génique apporte un intérêt thérapeutique (ménopause, cancers hormonodépendant) et des intérêts dans les domaines de la santé publique et de l’écologie (perturbateurs endocriniens). Nous avons développé deux modèles de biocapteurs reposant sur le principe de Résonance Plasmonique de Surface. Une telle démarche permet de réduire le coût et le temps expérimental nécessaire au criblage d’une chimiothèque. Par ailleurs, la validation de l’utilisation de tels outils nécessite la corrélation des résultats à ceux obtenus à l’aide d’un modèle biologique plus complexe. Ainsi, nous avons développé, un modèle de cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) transfectées par un vecteur rapporteur. La mise en place en parallèle de ces deux modèles a permit d’identifier un nouveau phytoestrogène agoniste de REα : la 7-O-β-Dglucopyranolychrysine. L’un de nos biocapteurs est compatible avec l’étude des interactions protéines/protéines. Nous avons donc appliqué ce modèle à la recherche de partenaires de la protéine GEC1 codé par un gène régulé par les estrogènes. En conclusion, nous avons développé en parallèle des biocapteurs ADN/protéine et un modèle cellulaire permettant l’identification de xénoestrogènes (7-O-β-D-glucopyranolychrysine), ainsi qu’un biocapteur protéines/protéines permettant le criblage de partenaires protéiques.

La quiescine/sulfhydryl oxydase QSOX1 catalyse la formation de ponts disulfures. In vivo, ses substrats et ses rôles cellulaires restent à déterminer. Les stress oxydants sont notamment impliqués dans les maladies neurodégénératives. L’hormone estradiol-17b (E2) possède des effets neuroprotecteurs. Nos objectifs ont été d’étudier la régulation de l’expression de QSOX1 par E2 et son implication dans les stress oxydants et la neuroprotection par E2. Nous avons ensuite étudié la régulation de l’expression de QSOX1 dans le cerveau de Rates ovariectomisées traitées ou non par E2. Dans trois aires cérébrales , le niveau de messagers QSOX1 diminue en et ERexprimant fortement ER présence de E2. Enfin, nous avons étudié l’implication de QSOX1 dans les stress oxydants. Dans les cellules PC12 soumises au stress oxydant, l’expression des messagers et de la protéine QSOX1 augmente. Suite au stress oxydant, la viabilité des cellules MCF-7 surexprimant QSOX1 diminue moins fortement que celle des cellules contrôles. La diminution de l’apoptose est associée à une moindre dépolarisation des mitochondries dans ces cellules. Nos travaux ont ainsi permis de confirmer l’estrogéno-dépendance de QSOX1 in vivo et de montrer pour la première fois le rôle de QSOX1 dans la protection des cellules contre l’apoptose induite par les stress oxydants. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives et renforcent l’intérêt de l’étude de QSOX1 dans la neuroprotection par E2.

Pendant une période précoce de son développement, le système nerveux central (SNC) est caractérisé par l'apparition de segments transversaux organisés le long du tube nerveux : les neuromères. Il a été montré qu'au sein des neuromères (prosomères pour le diencéphale), les progéniteurs neuronaux sont le siège de l'expression combinée et localisée de gènes spécifiques indispensables à la maturation des structures ou de certaines populations neuronales. Cependant, dans le diencéphale des mammifères, l'étude de l'expression de gènes du développement ne suffit pas à élucider les frontières de prosomères potentiels, qui restent donc très discutées. - Nos travaux concernent l'hypothalamus latéral postérieur de rat, où sont notamment localisées deux populations neuronales impliquées dans des réponses similaires (cycles veille-sommeil, prise alimentaire) et projetant dans l'ensemble du SNC : les neurones à hypocrétine (Hcrt) et les neurones producteurs de l'hormone de mélano-concentration (MCH). La distribution de ces deux populations neuronales ne respecte pas les frontières cytoarchitectoniques classiques de l'hypothalamus. Ainsi la distribution des neurones à MCH est restreinte à ladite zone à MCH , qui dérive d'un territoire particulier du neuroépithélium germinatif, et au sein de laquelle ont été individualisées au moins deux sous-populations définies en fonction de leur date de naissance et de leur phénotype chimique. Par ailleurs, les neurones à MCH sont détectés précocément au cours du développement. Nous avons donc utilisé une approche développementale pour essayer de comprendre la signification anatomique de la distribution des neurones à MCH, qui évoque certaines distributions spatiotemporelles de gènes du développement. - Les neurones à Hcrt étant colocalisés avec les neurones à MCH, nous avons tout d'abord voulu déterminer leur date de naissance et comparer ces résultats à ceux concernant la genèse des neurones à MCH. En utilisant la méthode au 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) et une technique de double marquage immunohistochimique BrdU/Hcrt, nous avons montré que 70% des neurones à Hcrt naissent au 12ème jour de vie embryonnaire. Les neurones à Hcrt sont générés en un pic étroit, ce qui explique leur distribution dans une aire incluse dans celle des neurones à MCH. Ce pic est encadré par ceux des deux sous-populations MCH, ce qui suggère que les neurones à Hcrt pourraient envoyer des collatérales à la fois vers le cortex et la moelle épinière. - Cette étude visait également à analyser les profils d'expression de cinq gènes du développement impliqués dans la mise en place du diencéphale (Pax6, Nkx2.1, Nkx2.2, DIx et Oln) et de les comparer à la distribution des neurones à MCH ainsi qu'aux premiers tractus de fibres. Par immunohistochimie et hybridation in situ, nous avons pu confirmer que la zone à MCH naît et se différencie dans un territoire caractérisé par l'expression d'une combinaison spécifique de facteurs de transcription. Ainsi, dès la naissance des premières cellules du manteau, au moins trois des gènes étudiés sont clairement exprimés dans ce territoire : il s'agit de Nkx2.l, Nkx2.2 et DIx. Cette zone à MCH est également adjacente au premier tractus longitudinal du diencéphale ou tractus post-opticus, issu de neurones de la région rétrochiasmatique. Par ailleurs, nous supposons l'existence d'un effet répressif, direct ou indirect, du gène Pax6. Notons que chez les souris homozygotes Pax6-/-, le gène MCH est exprimé de façon ectopique dans les aires du thalamus ventral. - Ce travail comporte la description de la distribution de ces facteurs de transcription et des premiers tractus de fibres dans le diencéphale ventral de rat. Cette analyse détaillée était indispensable à l'interprétation de nos données concernant les neurones à MCH et visait également à accéder à une meilleure compréhension de l'organisation anatomique de l'hypothalamus.