13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" Débat et questions autour des conférences de la deuxième session >> Nancy Terrier / Précurseurs des éthylphénols dans le raisin >> Isabelle Masneuf / De l'analyse de la diversité génétique de Brettanomyces bruxellensis vers le développement de nouveaux outils de diagnostic de la contamination
Mot(s) clés libre(s) : oenologie, Brettanomyces, Phénols, Vin

13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" Débat et questions autour des conférences de la première session >> Aline Lonvaud-Funel / Des recherches sur Brettanomyces : anciennes, redondantes maius aussi... en plein renouveau>> Arnaud Didier / Phénols volatils en cidrerie : spécificités cidricoles, gestion du risque et perception par les consommateurs>> Sophie Tempère / Impact sensoriel des éthylphénols : approches perceptive et cognitive>> Cornélis (Kees) Van Leuuwen / L'augmentation du pH des moûts et es vins, un facteur important de développement de Brettanomyces
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" Le pH du vin joue un rôle clé dans la dynamique des populations de Brettanomyces : plus le pH du vin est élevé, plus le risque d’un développement de Brettanomyces est important. On observe depuis une quarantaine d’années une augmentation régulière des pH des moûts et des vins, ce qui augmente mécaniquement le risque de déviations aromatiques liées à la présence de levures de contamination. Sur une importante série d’analyses de moûts au moment de la récolte dans la région de Languedoc, l’augmentation de pH est de 0,2 unité en 30 ans. Une autre série d’analyses, provenant d’une parcelle de Cabernet-Sauvignon du réseau de l’ISVV dans le Bordelais, montre une augmentation de 0,35 unité en 30 ans. On peut s’interroger sur le ou les causes de cette modification très importante de la composition du moût au moment de la récolte. Parmi les facteurs qui ont un impact sur le niveau du pH du moût, il est possible de hiérarchiser l’effet du sol, du cépage et du millésime. Des analyses de variance à trois facteurs de données provenant de Bordeaux et de Chablis montrent des résultats reproductibles d’une région à une autre. Ces trois facteurs ont un effet significatif sur le pH du moût, mais le pourcentage de variance expliqué par l’effet millésime (qui représente la variabilité climatique interannuelle) est très supérieur au pourcentage de variance expliqué par le cépage et le type de sol. Le pH du moût est plus élevé dans les millésimes chauds. Par conséquent, il est légitime de penser que le réchauffement climatique participe, au moins en partie, à l’augmentation du pH des moûts. Concernant l’effet du sol, le pH peut être influencé par plusieurs mécanismes: soit par la nutrition minérale, soit par un effet du régime hydrique sur la maturité. Il n’est pas facile de mettre en évidence un lien direct entre la composition minérale du sol d’une part et la composition minérale du moût et son pH d’autre part. On peut en revanche observer que des conditions d’alimentation en eau non limitantes peuvent contribuer à un retard de maturité, associé à des teneurs plus élevées en acide malique du moût et des pH plus bas. Il est possible de modifier le pH du moût et du vin par une fertilisation potassique excessive, mais il n’y a pas d’effet notable de la nutrition potassique de la vigne sur le pH du moût si l’on reste à des niveaux de fertilisation potassique raisonnables (<60 u / ha /an).Au cours des dernières décennies, les raisins ont été récoltés progressivement à des stades de maturité de plus en plus avancés. Il était courant de vendanger le raisin 35 jours après la mi-véraison dans les années 1960 et 1970. On est passé progressivement à 45 jours, puis 55 jours. Il n’est aujourd’hui pas rare de vendanger à plus de 60 jours après la mi-véraison des raisins destinés à l’élaboration de vins rouges de garde. Il est très probable que cette évolution ait un impact majeur sur le pH des moûts et des vins. Dans un premier temps, il était parfaitement légitime de rechercher une meilleure maturité du fruit pour limiter les flaveurs herbacées et pour augmenter la maturité des polyphénols. On peut néanmoins s’interroger si l’on n’est pas allé trop loin dans la recherche d’une maturité poussée du raisin au moment de la récolte, surtout dans un contexte de réchauffement climatique, déjà favorable à une augmentation des pH des moûts. Parmi les autres facteurs qui peuvent influencer le pH du vin, on peut également citer la pratique de la saignée. Puisque les pellicules du raisin sont plus riches en potassium que la pulpe, la pratique de la saignée, qui consiste à augmenter le rapport marc / jus, contribue à une augmentation de la teneur en potassium du vin et de son pH.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" La présence de phénols volatils dans le vin (éthyl-phénols) peut, lorsque ces composés atteignent une certaine concentration, aboutir à une dépréciation qualitative de ce vin. La synthèse de ces composés est attribuable à la présence et au métabolisme de levures du genre Brettanomyces. Ces phénols volatils dans le vin sont synthétisés à partir de précurseurs présents dans le raisin: des composés phénoliques appartenant à la famille des acides hydroxycinnamiques (ou acides phénols).Au cours de cette présentation, des éléments de réponse aux questions suivantes seront présentés:- Sous quelle forme les acides hydroxycinnamiques existent-ils dans le raisin? Toutes les formes d’acides hydroxycinnamiques sont-elles équivalentes comme substrat pour la production de phénols volatils?- Comment sont-ils synthétisés et à quelle période de la vie du fruit? Où se trouvent-ils dans la baie? La date de récolte et le mode d’extraction ont-ils un impact sur la concentration de ces précurseurs dans le moût?- Quels sont les facteurs (cépage cultivé, conditions environnementales, état sanitaire de la vendange) qui peuvent faire varier leur concentration dans la vendange?
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" La filière vitivinicole doit faire face à de nouveaux défis dans une quête constante de la qualité. La mission des commissions de dégustation dans l’attribution des AOC consiste à vérifier l’acceptabilité du produit au sein de son appellation. Ceci doit se faire après avoir obtenu l’assurance de l’absence de défaut qualitatif rédhibitoire convenablement décrit par la terminologie spécifiée par la filière et sélectionnée par l’ODG. Cependant, bien qu’il existe un consensus important pour certains motifs de refus des vins (caractères acescent, acétique, oxydé ou moisi, etc.), on observe des débats importants pour d’autres caractères organoleptiques. Un des exemples les plus marquants est celui du défaut phénolé dont l’odeur est décrite comme cuir, sueur de cheval, étable ou encore pharmaceutique. L’impact organoleptique de ce caractère dans les vins est parfois âprement discuté par les professionnels. L’objectif de nos travaux a donc été d’évaluer l’influence des capacités sensorielles, mais aussi des caractéristiques socioprofessionnelles des dégustateurs sur l’appréciation et le jugement du défaut phénolé des vins.Nos résultats indiquent un effet de l’apprentissage sur l’appréciation du caractère phénolé. Ils mettent en avant une influence de l'âge et de la profession sur les capacités olfactives, mais aussi sur des critères décisionnels du sujet qui interviennent dans le jugement des vins. L’influence conjointe de ces deux facteurs, nous permet d’envisager un effet de la connaissance ou de l'expérience sur le jugement de ce défaut. Rappelons que les marqueurs du caractère phénolé ont été correctement définis dans les années quatre-vingt-dix et c’est à partir de cette époque que ce caractère a été enseigné comme défaut rédhibitoire des vins, masquant les arômes variétaux et fruités.Afin de compléter la caractérisation sensorielle de ce défaut, nous nous sommes intéressés à cette dernière propriété sensorielle des éthylphénols. En effet, la plupart des études se focalisent sur le seuil de détection ou le seuil de rejet des défauts, mais peu aux effets de masquage des notes qualitatives des vins par ces composés. Nos résultats démontrent que la perception des notes fruitées des vins peut être masquée par la présence d’éthylphénols à des concentrations largement en dessous du seuil. Cette observation permet de donner une nouvelle définition des défauts dans les vins et de discuter de l’origine sensorielle et cognitive de cet effet perceptif.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" En vallée du Rhône, comme ailleurs, la présence de Brettanomyces et leur production de phénols volatils restent une cause de défaut dans les vins. Pour y faire face, différentes techniques de prévention du développement de cette levure existent et sont utilisées par les producteurs. Pour éviter leur prolifération, il est possible d’utiliser des additifs comme les SO2 ou le DMDC, ou bien d’avoir recourt à des techniques de traitement physique comme la flash pasteurisation ou la microfiltration tangentielle. Ces différentes techniques ont été testées par Inter Rhône au cours de ces dix dernières années, et se sont avérées efficaces vis-à-vis de populations de Brettanomyces. Il a également été montré que la concentration en SO2 reste un paramètre important pour le développement de la levure, et que les paramètres liés tels que la température et le pH ont une interaction évidente sur sa prolifération.Lorsqu’une contamination en Brettanomyces n’a pu être évitée, les vins peuvent alors présenter des concentrations en phénols volatils importantes. Une méthode pour les éliminer a ainsi été développée et validée à Inter Rhône en collaboration avec Bucher Vaslin. Le procédé comprend deux étapes réalisées en continu: extraction des phénols volatils par nanofiltration puis rétention des phénols volatils par passage du perméat sur une colonne de charbon. Des vins altérés présentant chacun des concentrations en phénols volatils différentes jusqu’à 2400 μg. L-1 ont été traités. Le traitement a permis de réduire la concentration en phénols volatils en dessous du seuil de perception (420 μg. L-1), quel que soit le niveau de concentration initiale. La structure et la couleur du vin n’ont pas été modifiées. L’impact sur les autres composés aromatiques est resté faible, mais a permis la révélation de notes fruitées jusqu’alors masquées. En effet, les vins traités ont été perçus à la dégustation moins « animaux », mais plus « fruités » et « plus complexes ». Cette méthode acceptée par l’OIV est en cours d’intégration dans les textes européens.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" Brettanomyces, une levure d’altération bien connue du milieu viticole, trouve d’excellentes conditions de prolifération dans la pratique de l’élevage en barrique. En effet, cette levure prolifère dans les vins peu clarifiés, qui subissent peu de transferts, dont la teneur en SO2 libre passe régulièrement en dessous du seuil critique et dont la température est stable et douce. Néanmoins, on peut aussi rencontrer ces conditions lors d’un élevage en cuve inox. Alors comment expliquer la prolifération accentuée de Brettanomyces lors d’un élevage sous bois ? Au-delà des conditions physico-chimiques qui favorisent la présence de la levure d’altération, le niveau d’hygiène s’avère primordial. Mais cette notion de « niveau d’hygiène » doit être affinée pour ne plus être assimilée à l’idée que l’hygiène apparente d’un chai est corrélée aux quantités de microorganismes qui y vivent. La « propreté » du chai doit se raisonner à l’échelle microscopique. Le bois est un milieu si poreux que les Brettanomyces peuvent le pénétrer jusqu’à un centimètre de profondeur, et lorsqu’elles y sont, il est impossible de les éradiquer totalement. En l’état actuel, l’idée de stériliser une barrique est à abandonner. Aussi, la dissémination des microorganismes s’entretient à chaque entonnage en barrique usagée, dans un cycle sans fin à l’échelle du chai. Peut-on, au moins, freiner cette dissémination ? Il est inutile de s’alarmer inutilement car Brettanomyces ne génère d’altération que lorsque sa population atteint un niveau critique. En pratique, choisir les procédés de nettoyage les plus efficaces (banc d’essai Inter Rhône), les associer dans une procédure de routine maintenant la population en dessous du niveau critique, et savoir réagir rapidement quand elle dépasse ce niveau. Cela nécessite un suivi quantitatif des microorganismes du vin et du bois. La limite de ce suivi microbiologique est que les Brettanomyces qui survivent au nettoyage entrent souvent dans un état de résistance, les fameuses « VNC ». La PCR est un outil adéquat pour quantifier ces cellules VNC, mais les extraire du bois nécessite un protocole particulier.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" Le vin est le fruit d’une transformation par une communauté microbienne d’un milieu naturel biologiquement instable. Certaines phases de son élaboration, fermentations alcoolique et malolactique, sont bien maîtrisées à ce jour, en partie grâce aux levains du commerce. Il est, bien entendu, possible de faire du vin sans utiliser ces outils, mais il faut alors s’en remettre à dame nature et accepter de perdre un peu de maîtrise sur la sélection d’une microflore active. Cette démarche, parfois motivée par la recherche d’une complexité aromatique, peut s’avérer exceptionnelle, mais aussi être malheureusement catastrophique. Produire un vin bio au sens technique du terme ne peut se limiter à une liste de pratiques d’usages qui diffèrent en fonction du cahier des charges d’une charte donnée, qu’elle soit règlementaire ou privée. Cette démarche témoigne d’une dérive liée à notre formation scientifique, à une façon de penser. Notre approche, plutôt cartésienne est parfaitement adaptée à l’étude de systèmes stables où l’on peut se focaliser sur une cause afin d’en éviter les effets, en essayant, au passage, d’y apporter une explication logique. Le vin doit être considéré comme un milieu vivant dans sa complexité. Nous pourrions parler d’un « écosystème » complexe avec des interactions dynamiques entre les éléments et leur environnement: un système en mouvement perpétuel où la notion d’équilibre est fondamentale. Le rationalisme analytique n’est alors plus suffisant pour appréhender ce système où la notion d’interaction supplante la simple relation de cause à effet qui domine la science classique. À défaut de connaitre parfaitement les Bretts, il faut s’intéresser à la nature et la forme de l’interaction. L’optimisation de la gestion de ces populations indésirables passe par une évolution de notre façon de penser: on pourrait parler d’approche systémique. L’objectif pratique est d’apporter une méthodologie qui nous conduise à objectiver notre approche, d’apporter un outil d’aide à la décision qui nous permette d’adapter au mieux nos pratiques oenologiques tout en respectant un milieu vivant.En agriculture biologique, la prévention doit rester la règle prioritaire, les altérations microbiennes, les maladies en général ne doivent être considérées que comme le signal d’une situation de déséquilibre. La tâche reste délicate, car il faut trouver le juste compromis entre le « vivre avec la nature » en respectant la complexité des équilibres naturels sans rationalisation excessive et le « contrôle de la nature » qui peut facilement dériver vers son exploitation.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" L'analyse microbiologique du vin est un outil indispensable dans la prévision des risques d'altération de la qualité organoleptique et visuelle du vin. Concernant plus précisément la lutte contre la production des phénols volatils, l’enjeu majeur est la détection précoce de Brettanomyces bruxellensis. Autrefois négligée, la microbiologie est aujourd’hui de plus en plus prise en compte par les producteurs, devenus plus réceptifs aux aspects microbiologiques de la vinification. L'analyse microbiologique peut donner deux types d’informations: le nombre de microorganismes présents et/ou leur nature avec plus ou moins de spécificité. Les deux informations couplées ne sont pas toujours nécessaires; le dénombrement peut parfois être suffisant. Cependant, dans la prévision des risques ou le diagnostic d'altération, il est souvent nécessaire de connaître la nature des micro-organismes et de les identifier au niveau de l'espèce. Les méthodes courantes font essentiellement appel à la microbiologie dite « classique » avec les méthodes microscopiques, très rapides, mais peu sensibles et sans possibilité d'identification. Parmi ces méthodes classiques, se retrouvent aussi les méthodes de culture sur milieu nutritif gélosé qui sont très utilisées du fait de leur faible coût et de leur seuil de détection très bas. Cependant, elles ont deux inconvénients majeurs: les délais de réponse en raison de la lenteur de développement des microorganismes et l'impossibilité de discriminer ces microorganismes au niveau de l’espèce. S'agissant de B. bruxellensis, sept jours au minimum sont nécessaires et les milieux de culture les plus discriminants permettent d’exclure les Saccharomyces, mais pas de nombreuses autres espèces de levures non-Saccharomyces. Le dénombrement spécifique de B. bruxellensis n'est donc pas possible de cette façon. D'un autre côté, les techniques microscopiques ou bien la cytométrie de flux, bien que séduisantes par leur rapidité manquent aussi de spécificité et quelquefois de sensibilité. Aucune de ces méthodes n'est donc compatible avec la réactivité et la spécificité parfois nécessaires pour intervenir afin de limiter un développement excessif de B. bruxellensis.Aujourd'hui, après des années d'utilisation la technique la mieux éprouvée, alliant spécificité vis-à-vis de l’espèce et rapidité (moins d’une journée) est la PCR quantitative (qPCR). Inscrite au Recueil international des méthodes d’analyses de l’OIV depuis 2011, la quantification de B. bruxellensis par q PCR se généralise dans les laboratoires d’analyses oenologiques. Récemment, de nouvelles techniques émergent ou sont améliorées comme la cytométrie de flux, rendue depuis peu spécifique de l’espèce B. bruxellensis en utilisant l'immunofluorescence. Cette technique semble présenter des qualités intéressantes quant au délai de réponse et à la spécificité vis-à-vis de B. bruxellensis, mais, pour le moment, elle en est encore au stade du lancement.
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13e Matinée des Oenologues de Bordeaux / "Cherchons la p'tite Brett" L’importance croissante de la thématique « B. bruxellensis » à l’échelle mondiale a suscité de nombreux travaux de recherche, qui ont pour principales vocations de mieux comprendre comment limiter le développement de la levure d’altération dans le vin et l’apparition du défaut olfactif. En revanche, peu de données existent concernant la biologie de cette levure et sa diversité génétique. Actuellement, les méthodes analytiques de diagnostic consistent principalement à réaliser un suivi des teneurs en phénols volatils et à quantifier les niveaux de population de B. bruxellensis. Mais les informations relatives à la nature de(s) souches présentes dans l’échantillon contaminé ne sont pas accessibles. La publication récente de la séquence du génome de plusieurs souches de B. bruxellensis ouvre des perspectives nouvelles, pour mieux comprendre la biologie de cette espèce (Curtin et al., 2012; PiŠkur et al., 2012). Ainsi, le séquençage du génome de plusieurs souches indique que B. bruxellensis est une espèce très complexe, avec un nombre de copie de chromosome variable d’une souche à l’autre, et l’existence d’individus hybrides (Borneman et al., 2014).  Cette très grande diversité génétique permet de mieux interpréter les études antérieures, montrant que les activités métaboliques de B. bruxellensis, associées à la contamination des vins et en particulier la résistance aux sulfites, seraient « souches-dépendantes ». À partir des séquences de génomes publiées, nous avons développé une nouvelle méthode de typage des souches de B. bruxellensis basées sur l’analyse de 10 marqueurs microsatellites (Albertin et al., 2014). Des résultats préliminaires, obtenus sur des isolats du bordelais, montrent i) qu’il existe un « groupe bordelais » (délimité par la proximité génétique des souches), qui contient aussi des isolats australiens résistants aux sulfites, ii) qu’une population clonale de B. bruxellensis peut être retrouvée dans les vins d’un même cru sur plusieurs dizaines d’années, iii) dans certains cas, les souches isolées de grappes présentent un profil différent de celles provenant du premier ou du second vin. Ces nouveaux outils de diagnostics vont permettre de mieux cerner l’origine de la contamination dans un cru donné et la « dangerosité » des souches qui contaminent le vin, et ainsi adapter les itinéraires de prévention et/ou traitement de la contamination.
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